Nueva versión de la UNE-EN ISO 15216-2 para la determinación de norovirus en alimentos

Nueva versión de la UNE-EN ISO 15216-2 para la determinación de norovirus en alimentos

microbiologia alimentaria

La Asociación Española de Normalización y Certificación (AENORinfo-icon) ha publicado una nueva versión de la norma UNE-EN ISO 15216-2, que describe un método para la detección de los norovirusinfo-icon de los genotipos  I (GI) y II (GII) y del virusinfo-icon de la hepatitis A en muestras de determinados productosinfo-icon alimenticios y de superficies alimentarias, mediante la técnica RT-PCRinfo-icon  (reverse-transcriptase polymerase chain reaction) a tiempo real. 

 

Los norovirus y el virus de la hepatitis A (HAV) son agentes importantes de enfermedades virales humanas transmitidas por los alimentosinfo-icon. Dado que no existen métodos de rutina para cultivar norovirus y los métodos de cultivo de HAV no son apropiados para la aplicación de rutina a las matrices alimentarias, la detección de estos patógenosinfo-icon depende de métodos molecularesinfo-icon que utilizan la reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR).

La norma UNE-EN ISO 15216-2, de la que AENOR acaba de publicar una nueva versión, describe un método para la detección del virus de la hepatitis A (HAV) y de los norovirus de los genogrupos I (GI) y II (GII) a partir de muestras de ensayo procedentes de los siguientes productos alimenticios: frutas blandas, hojas, tallos y bulbos de vegetales, aguainfo-icon embotellada y moluscos bivalvos (BMS) o de superficies alimentarias, mediante el uso de RT-PCR a tiempo real.

Como muchas matrices de alimentos contienen sustancias que inhiben la RT-PCR, es necesario utilizar un método de extracción que produzca preparaciones de ARN altamente limpias, que sean adecuadas para su propósito. El método de extracción varía según la matriz de la muestra.

En el caso de las superficies, los virus se extraen con hisopos. Para frutas blandas y vegetales de hoja, tallo y bulbo, la extracción del virus se realiza mediante elución con agitación seguida de precipitación con PEG / NaCl.  Para el agua embotellada, se utiliza la adsorción y elución, usando membranas cargadas positivamente, seguido de concentración por ultrafiltración y en el caso de los moluscos bivalvos (BMS), los virus se extraen de los tejidos de las glándulas digestivas mediante el tratamientoinfo-icon con una solución de proteinasa K. Todas las matrices comparten un método de extracción de ARN común, basado en la interrupción de la cápside del virus con reactivos caotrópicos seguido de la adsorción de ARN a partículas de sílice.

La UNE-EN ISO 15216-2 Microbiología de la cadena alimentariainfo-icon. Método horizontal para la determinación del virus de la hepatitis A y norovirus utilizando RT-PCR en tiempo real. Parte 2: Método para la detección (ISO 15216-2:2019) es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN ISO 15216-2:2019 y sustituye a la Norma UNE-CEN ISO/TS 15216-2:2013, que ha sido revisada técnicamente.

Los principales cambios, que se consideran menores, respecto a la versión de 2013 son: 

  • Se ha añadido el requisito de utilizar un tampón adecuado para la dilución de los materiales de controlinfo-icon;
  • Se ha cambiado el método para generar el ARN del virus de control de proceso para la curva estándar;
  • Se han añadido puntos de corte con una temperatura y parámetros de tiempo definidos en los métodos de extracción;
  • La terminología ha cambiado de "eficiencia de amplificación" a "inhibición de RT-PCR";
  • Se han agregado reacciones adicionales de RT-PCR en tiempo real para muestras de ARN y controles negativos;
  • Se han añadido las características del método y los resultados de los estudios de validación del método.

El método descrito en esta norma no se ha validado para la detección de los virus objeto de estudio en otros productos alimenticios (incluidos los productos alimenticios compuestos de múltiples componentes), ni para ninguna matriz diferente, ni para la detección de otros virus en los productos alimenticios, las superficies alimentarias ni en otras matrices diferentes.

Contenido de la norma

Prólogo europeo 
Declaración 
Prólogo 
0 Introducción
1 Objeto y campo de aplicación 
2 Normas para consulta .
3 Términos y definiciones 
4. Principio
4.1 Extracción de los virus
4.2 Extracción de ARN 
4.3 RT-PCR a tiempo real 
4.4 Materiales de control
4.4.1 Virus de control del proceso
4.4.2 EC-ARN de control 
4.5  Resultados del ensayo 
5  Reactivos
5.1 Generalidades
5.2 Reactivos utilizados tal como se suministran
5.3 Reactivos que requieren preparación
6 Equipamiento y material fungible
7 Toma de muestrasinfo-icon 
Procedimiento
8.1Requisitos generales del laboratorioinfo-icon 
8.2 Extracción de los virus
8.2.1Generalidades
8.2.2 Preparación del virus de control del proceso
8.2.3 Control negativo del proceso
8.2.4 Superficies alimentarias 
8.2.5 Frutas blandas, hojas, tallos y bulbos de vegetales
8.2.6 Agua embotellada 
8.2.7 Moluscos bivalvos (BMS)
8.3 Extracción de ARN
8.4 RT-PCR a tiempo real 
8.4.1 Requisitos generales
8.4.2 Análisisinfo-icon mediante RT-PCR a tiempo real 
9  Interpretación de los resultados
9.1Generalidades
9.2 Construcción de la recta patrón del virus de control del proceso
9.3 Control de la inhibición de la RT-PCR
9.4Cálculo de la eficiencia de extracción 
10 Expresión de los resultados
11 Características de funcionamiento del método
11.1 Estudio de validación 
11.2 Sensibilidad
11.3 Especificidad
11.4 LD 50 
12 Informe del ensayo 
Anexo A (Normativo) Diagrama del procedimiento
Anexo B (normativo) Composición y preparación de los reactivos y disoluciones tamponadas 
Anexo Cinfo-icon (Informativo) Mezclas de reacción para RT-PCR a tiempo real y parámetros de reacción de PCR
Anexo D (Informativo) Cebadores para RT-PCR a tiempo real y sondas de hidrólisis para la detección de HAV, norovirus GI y GII y mengovirus (control del proceso)
Anexo E (Informativo) Crecimiento de la cepainfo-icon MC 0 de mengovirus para su uso como virus de control del proceso
Anexo F (Informativo) Extracción de ARN utilizando el sistema NucliSens® 
Anexo G (Informativo) Generación de las preparaciones concentradas de ARN de control externo (EC-ARN) 
Anexo H (Informativo) Diseño típico de una placa óptica
Anexo I (Informativo) Estudios de validación del método y características de funcionamiento
Bibliografía

 

Fuente: AENOR

 

 

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