El método de dilución-neutralización es uno de los procedimientos del tipo in vitro utilizados en la valoración de la actividad de un antiséptico o desinfectante en su función de eliminación de microorganismos patógenos.

El principio básico es el de determinar la CMB (Concentración Mínima Bactericida), que es la mínima concentración de desinfectante ensayada capaz de reducir en 5 unidades logarítmicas (10^-5) una suspensión de bacterias en 5 minutos de contactocon el desinfectante a 20°C.

Se parte de una suspensión bacteriana que debe contenetr entre 1 x 10⁸ y 3 x 10⁸ bacterias/ml. En el ensayo del desinfectante, se hace una dilución de éste con el neutralizante en una proporción 1/10. En el caso del neutralizante, la dilución es de 1/2 y la concentración del desinfectante es de 1/2.

Se utilizan los reactivos siguientes:

• Agua destilada estéril
• Agar recuento
• Desinfectante
• Neutralizante
• Diluyente

Procedimiento:

• Suspensiones bacterianas
  • Se siembran las cepas y se les dan tres pases de cultivo en agar mantenimiento con intervalos de 18-24 horas (el intervalo se alarga en cepas de crecimiento más lento).
  • Fusión y mantenimiento en sobrefusión del medio de cultivo en baño termostatizado a 50°C.
  • Incorporación del diluyente y arrastre del cultivo.
  • Ajuste de la suspensión bacteriana los valores de absorvancia necesarios.
  • Preparación de diluciones seriadas a partir de las suspensiones bacterianas de ensayo obtenidas.
  • Obtención de las placas de recuento e inventario de colonias

• Ensayo del neutralizante
  • Fusión y mantenimiento en sobrefusión de 6 tubos de agar recuento.
  • Preparación de tubos de agua destilada estéril y desinfectante.
  • Adición de neutralizante.
  • Adición y agitación de la dilución bacteriana.
  • Recuento en placa e incubación.
  • Nuevo recuento de las placas y obtención de valores medios.

• Ensayo del desinfectante
  • Fusión y sobrefusión de los tubos de agar recuento.
  • Preparación de tubos de neutralizante.
  • Preparación de tubos de desinfectante.
  • Adición y agitación de la suspensión de ensayo
  • Adición y agitación de neutralizante.
  • Recuento en placa e incubación.
  • Nuevo recuento de las placas y obtención de valores medios.

Nota: resumen del artículo Valoración de desinfectantes. Método de dilución-neutralización de A, Álvarez Alcántara, E. Espigares Rodríguez y R. Gálvez Vargas. Ver artículo completo (en pdf)